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化合物活性测试筛选-体外测试概论

发布时间:2019-10-14  来源:  浏览人数:112

化合物活性测试筛选指的是采用适当的方法,对可能作为化合物使用的物质(采样)进行生物活性、药理作用及药用价值的评估过程。

现在化合物活性测试筛选方法基本都是在20世纪50年代逐步发展起来的。20世纪50年代化合物发现主要是依靠细胞和动物模型,一般是表型筛选。由于对酶和酶动力学研究的不断深入,基于组织/器官的表型筛选得到了迅速发展。在这个阶段数以百计的酶被发现和纯化,成为重要的化合物发现分子靶点。20世纪70年代,酶动力学的方法学研究被延伸应用到受体药理学,受体药理学逐渐成为化合物发现的热点研究领域。20世纪80年代后期,分子生物学和基因组学的发展开启了基于分子靶点的化合物发现时代。重组DNA技术和重组蛋白质等技术方法的应用,建立了大量基于化合物作用靶点的筛选模型,可利用细胞株或生物分子的相互作用筛选庞大的化合物库。20世纪90年代,随着生命科学的发展和生物技术的进步,基于靶点的化合物发现模式逐渐取代了传统的基于化合物化学结构的发现模式,成为现代创新化合物研发的主流模式。也就是,我们能够基于某个分子靶点进行高通量筛选,可以获得小分子和靶蛋白的复合晶体结构。这些技术取得了很大的成功,今天仍然在不断丰富和发展当中。

一、体外实验

体外筛选,可以总体分为靶点水平细胞水平

1.1 靶点水平

1.1.1 酶

以酶为作用靶的高通量筛选方法,绝大多数是直接检测酶活性。具体方法根据酶的不同而不同,主要有基于放射性的方法和基于比色、荧光的方法两大类。

筛选作用于酶的化合物, 主要是观察化合物对酶活性的影响, 由于化合物与酶的相互作用也是分子间的结合, 也可以采用与靶点结合的方法进行检测。但是要根据酶的特点来决定。检测酶活性的方法很多, 酶的反应底物、产物都可用作检测指标,并可由此确定酶反应速度。

蛋白激酶(protein kinases),是一类催化蛋白质磷酸化反应的酶。它能把腺苷三磷酸(Adenosine triphosphate, ATP)上的γ-磷酸转移并共价结合到特定蛋白质分子中某些丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的羟基上,从而改变底物蛋白质及激酶的构象和活性。蛋白激酶内都存在一个同源的由约270个氨基酸残基构成的催化结构区。在细胞信号传导、细胞周期调控等系统中,各种蛋白激酶形成了纵横交错的网络,在细胞的生命活动中起了广泛的作用。

蛋白激酶按照对底物磷酸化位点的选择性,可分为受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、细胞周期依赖型激酶等。理论上凡是能检测到磷酸化产物的方法均可用于蛋白激酶的生化活性检测。但每种检测方法都需要根据激酶和底物的性质作出相应调整。

蛋白激酶抑制剂按照是否与ATP结合位点的“铰链区”结合及是否结合激酶的活性构象可分为4种类型。其中I型和II型的抑制剂构成了最常见的ATP竞争性抑制剂。

检测方法

由于以蛋白激酶作为靶点的一系列化合物的成功开发,各个试剂公司竞相开发相关的激酶检测方法和试剂盒,用于筛选和优化新的化合物作为新药候选者。其中以蛋白激酶的生化检测方法最为繁多,表3给出了一些常用检测方法、激酶抑制剂筛选试剂服务以及检测设备提供商。

图1.jpg

蛋白激酶的生化检测方法有2种不同的分类:

按照检测目标分类或者按照检测的方法学进行分类。

按照检测目标,可以分为检测ATP的消耗量、检测ADP的生成量、检测多肽底物以及检测激酶本身;

而按照检测的方法学分类,则有同位素标记分析法、质谱、核磁共振、反相高效液相色谱、毛细管电泳、生化检测方法等诸多手段。

虽然上述方法早已经见诸报道并被广泛应用,然而,现在最经常使用的还是放射性同位素标记ATP,荧光标记(包括荧光偏振\荧光共轭能量转移\时间分辨荧光以及化学发光等)检测方法。这些方法均以微孔板作为载体,具有试剂消耗量低,检测速度快,通量高的优点,成为较普遍应用的一些蛋白激酶检测方法。表4是常见的蛋白激酶生化检测方法的列举及优缺点比较。

图2.jpg

1.1、放射性同位素法

使用放射性同位素方法有诸多优点:它是直接检测的方法,放射性同位素的灵敏度很高,测试结果非常准确,被认为是蛋白激酶生化活性检测的“金标准”。因此,至今还有很多人继续使用放射性同位素作为检测激酶活性的方法。放射性同位素方法主要有膜过滤法和接近闪烁计数法两类。

放射性同位素方法有以下一些缺点:

(1)产生大量的放射性垃圾,对人体有一定的损害;

(2)放射性ATP的半衰期非常短,只有14天(32P)或者25天(33P),因此需要经常订购新的同位素;

(3)放射性同位素的能量非常高,有比较明显的交叉干扰现象,较难应用于化合物的高通量或者超高通量筛选。

1.2、非均相非放射性同位素法

由于放射性同位素存在上述一些缺点,科学家们开发了众多的非放射性激酶检测方法,包括酶联免疫法、高效液相色谱法、质谱法、核磁共振波谱法、毛细管电泳等。

1.3、均相非放射性同位素法

上述这些非均相的方法,存在操作繁多的问题。随着技术的发展,越来越多的均相非放射性方法开始被应用于激酶活性的检测之中,根据实验原理的不同,可以分为检测ATP的量、检测ADP的量、检测带标记或修饰的多肽底物、配体激酶结合法等。

虽然多个激酶抑制剂已经被FDA批准,作为化合物进行临床治疗,但在治疗过程中也暴露出不少问题。其中,有一个重要问题就是所谓的“脱靶效应”,即抑制剂除了靶向激酶以外,还会同时抑制其他一些非靶向激酶,并有可能引起一些细胞毒性反应。因此,必须在激酶抑制剂改造研究的前期,就增加激酶酶谱筛选(kinase profiling)。

迄今为止,已经涌现了如此众多的激酶检测方法,相信今后会有更多地方法加入其中。即使如此,由于人体激酶谱的复杂性,很难有能够适用于所有激酶检测或者适用于所有研究阶段的方法。因此,必须根据实际需要来进行相应的选择:

(1)对于高通量筛选(high throughput screening, HTS),应该尽量挑选价格便宜且信号窗口比较大的方法,同时速度快,易于操作。

(2)对于化合物优化设计阶段,应选择激酶使用量比较低的检测方法,这样检测限度也会比较低。

(3)在化合物设计中后期,必须要使用激酶酶谱进行筛选,以判断是否有“脱靶效应”。

(4)对于将要进入临床测试检验的候选化合物,要使用“金标准”放射性同位素方法进行确证。

1.1.2 受体

以受体为作用靶的高通量筛选方法,包括检测功能反应、第二信使生成和标记配体与受体相互作用等不同类型。检测功能反应的优点是易于区分激动剂和拮抗剂。经典的功能检测方法通量低,而引入基于重组技术的报告基因检测方法极大地提高了筛选通量,既高效且节省成本。

1.1.3 离子通道

离子通道功能检测依赖于对其介导的微小电流的测量,因技术手段的限制,化合物筛选通量较低成为离子通道化合物发现的瓶颈和关键步骤。研究离子通道功能的最直接方法是用膜片钳技术直接测定通过离子通道的电流或测量细胞膜电位的变化.膜片钳技术是利用一个玻璃微吸管电极完成膜片或全细胞电位的监测、钳制和膜电流的记录,通过观测膜电流的变化来分析通道个体或群体的分子活动、探讨离子通道特性。

1.1.4 核酸

以核酸为靶点主要基于当含芘的氨基甙类似物结合于RNA时,芘的荧光被淬灭的原理。在96孔板上,将芘碳酰巴龙霉素(PCP),RNA结构配成溶液后加入有受试化合物的板孔中,用荧光读板器考察荧光恢复的程度。

1.2细胞水平

细胞整体水平的筛选主要是采用鉴定杀死癌症细胞或外源性病原体包括细菌、真菌、原虫和寄生虫来筛选化合物。不同细胞活力测定法的分析试验原理涉及线粒体活性,细胞代谢或伴随活或死亡细胞酶活性。通过相对于细胞表型变化发现许多疾病特征,例如形态学变化,或在蛋白转运,表达,活性,或功能中差别。

基于细胞表型分析常进行三种类型,是细胞活力测定法,细胞信号通路分析,和疾病相关表型分析。根据细胞单一的生理反应进程可以将细胞的功能学检测方法分为4大类:

1、以细胞整体为研究对象,测定化合物作用后的最终响应情况,测定候选化合物引起细胞整理水平的变化,如细胞状态检测、分泌物检测等。

所采用的方法比较丰富多样,以整个细胞为对象测定细胞的增殖或者死亡(MTT、CCK-8、CTG、Alarmablue、ATP测定,LDH测定),细胞的蛋白组或者基因组变化(流式测定周期凋亡),细胞的转移迁移能力变化(划痕,侵袭,transwell实验),细胞分泌物的测定如PBMC细胞的TNF和IL定量测定(ELISA,TR-FRET)。
2、接收信号通路中的初始变化,测定候选化合物引起靶点蛋白最初的变化,最常见的是候选化合物和位于细胞膜上的靶点受体的结合,或者阻断靶点受体和天然配体的结合,如靶点蛋白结合

测定候选化合物引起靶点蛋白最初的变化,最常见的是候选化合物和位于细胞膜上的靶点受体的结合,或者阻断靶点受体和天然配体的结合,如靶点蛋白结合。一般而言被考虑是部分表型,信号通路分析蛋白–蛋白相互作用链接一个复杂的网络至转录激活和一个报告基因的表达(如荧光素酶,β-内酰胺酶或酶互补耦合)或荧光蛋白(GFP和YFP),产生一个可测量的发光或荧光信号。

有别于将靶点受体重组纯化出来进行亲和力评价,细胞膜上的靶点受体更接近真实的生理情况,位于细胞上的其他受体,效应蛋白可能会参与靶点蛋白的激活变化过程,更有参考价值。而且很多膜蛋白是多透膜结构,很难纯化得到完整三级结构构象的受体蛋白(如G蛋白偶联受体为7透膜)。

所采用的方法主要是Cell-Based Elisa、流式细胞术进行测定候选化合物-受体偶联物。
3、接收信号通路中信号放大变化,测定信号转导过程中信号通路中关键生物标志物的浓度,如第二信使或者激酶测定。例如GPCR(G-蛋白偶联受体)激活过程中第二信使cAMP, DAG, IP3(TR-FRET,ELISA)和 Ca 2 (FLIPR)的测定;关键效应蛋白磷酸化等修饰的浓度(TR-FRET,WB);关键酶酶浓度的测定;动力学转运过程的测定(内化)等。

       所采用的方法主要是TR-FRET,ELISA、ATP检测。
4、分析信号通路分析转录情况,测定引起细胞应答的转录和翻译水平的变化

对引起细胞应答的转录和翻译水平的测定。采用实时荧光定量PCR技术对转录RNA水平的测定;采用在启动子后面插入外源的报告基因测定转录因子的活性。

所采用的方法主要是PCR。

1.2.1 细胞增殖毒性

具体的实验就是采用MTT、CCK8、CTG等方法进行细胞活力的检测,就是检测细胞的死活数量。

细胞增殖是指细胞在周期调控因子的作用下,通过DNA复制、RNA转录和蛋白质合成等复杂反应而进行的分裂系列过程。细胞通过分裂的方式增殖,细胞增殖是生物体的重要生命特征。单细胞生物以细胞分裂的方式产生新个体,多细胞生物以细胞分裂的方式产生新的细胞,从而补充体内衰老和死亡的细胞。细胞增殖的同时,在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞,活细胞在总细胞中所占的百分比叫做细胞活力。

检测方法

检测细胞存活与增殖的方法主要包括观察DNA合成含量和检测细胞代谢活性两种,前者主要是DNA前体物质(胸腺嘧啶核苷类似物)掺入法,比如BRDU、EDU法;后者主要为MTT、XTT、MTS、CCK-8、WST-1及WST-8法等,在后者中现在最主流的就是CTG法。

图3.jpg

细胞增殖实验是化合物体外功能学筛选试验中的基本实验,在进行细胞增殖实验后,也可以进一步验证化合物对细胞转移、血管形成的影响。

这里以抗肿瘤化合物研究为例,自从上世纪80年代,美国国家癌症研究所(National Cancer Institute, NCI)逐渐建立起基于NCI-60细胞的抗肿瘤化合物体外筛选模式,是临床前筛选抗肿瘤先导化合物的有效方法,具有简单、直接、快速的优点。

图4.jpg

1.2.2细胞转移能力的变化

细胞的迁移运动不仅是细胞进行很多重要生理活动的基础,同时也是炎症反应和肿瘤发生等病理过程中的重要步骤和关键环节。细胞迁移 (cell migration) 也称为细胞爬行、细胞移动或细胞运动,是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。细胞迁移是正常细胞的基本功能之一,是机体正常生长发育的生理过程,也是活细胞普遍存在的一种运动形式。胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。细胞的转移迁移能力变化主要涉及的实验分为2类,一类是划痕,侵袭,另一类是Caco-2、PAMPA、MDCK。

检测方法

细胞划痕实验

是一种操作简单,经济实惠的研究细胞迁移能力的体外试验方法。其原理是,当细胞长到融合成单层状态时,在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域,即为“划痕”,划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。通过对不同时期划痕区域细胞状态的观察,对细胞的迁移能力进行判断。

细胞侵袭实验

主要是针对肿瘤细胞而言,通过侵袭实验可以研究各种细胞因子对肿瘤细胞侵袭和转移的影响,会应用到一些抑制血管生成的新药研究中,也会在研究肿瘤细胞侵袭和转移的机制中。

试验中很多人可能会混淆划痕与侵袭,不知道什么情况下进行哪一种实验,说明下的是看你研究的细胞类型咯,针对肿瘤细胞的实验,进行细胞侵袭检测,即进行transwell实验,监测通过细胞外基质的运动,往往比划痕实验更重要,所以优先考虑侵袭实验,辅以细胞划痕实验,如果是其他细胞呢,往往进行细胞迁移能力评价的实验,即细胞划痕就可以了。

Caco-2、PAMPA、MDCK这3种细胞通透性的实验是一类,他们的研究可以获得很多信息,可更加细致的了解化合物的透膜过程,包括蛋白的结合、溶酶体、酶和转运体等因素对透膜的影响。

Caco-2 cell monolayer

Caco-2 细胞系来源于人结癌,用以模拟化合物经小肠上皮的吸收过程。特点: Papp 与人小肠吸收相关性好。

主要用途:

1、研究化合物吸收转运机制;

2、新药筛选,预测生物利用度。

PAMPA(Parallel artificial membrane permeation assay)

是一种非细胞的体外透膜性研究方法,以卵磷脂膜代替细胞层,适于确定化合物脂溶性扩散。

对PAMPA实验结果与细胞实验结果进行分析比较, 能简便快速的确定化合物的转运是否存在被动扩散与其他转运方式。

MDCK cell monolayer

MDCK ( Madin Darby Canine Kidney) cells为肾远曲小管上皮细胞,是研究细胞调节、代谢,抗流感病毒研究的常用模型。 和 Caco-2 细胞一样,在半透膜上分化成柱状上皮单层,细胞间形成紧密连接,构成化合物转运的细胞屏障。与Caco-2相比,二者相关性好。

主要用途:

1、研究化合物肾小管重吸收机制;

2、新药筛选,代替Caco-2预测生物利用度;

3、血脑屏障模型研究。

1.2.4 细胞分泌物的测定

如单核细胞、免疫细胞等的TNF和IL定量测定(采用ELISA或TR-FRET方法进行检测),在与炎症相关的化合物筛选研发中运用的相当广泛。

检测方法:LDH分析、ELISA、TR-FRET、流式细胞术进行测定候选化合物-受体偶联物

1.2.5 细胞基因表达的变化

化合物对细胞的影响,可以在核酸水平上对目标基因的表达进行改变。

检测方法:PCR

体外测试与体内测试相比,首先是降低了筛选样品的用量。用整体动物进行化合物筛选,对样品的需求量一般在1-5g以上(根据用量和动物大小),而采用体外筛选模型筛选化合物,样品用量一般仅需整体动物的1/10-1/100或更少;

第二、降低劳动强度,扩大筛选规模,减少动物用量,特别是有些模型仅使用一小部分组织或者细胞,同一时间内可以进行多样品的筛选,提高了筛选效率,降低了筛选成本。

第三、减少了影响化合物作用的因素,易于评价化合物作用。

第四、细胞、分子水平的化合物筛选模型具有材料用量少、化合物作用机制比较明确、可实现大规模的筛选等特点,已经成为目前化合物筛选的主要方法。

第五、细胞分子水平化合物筛选模型的应用为自动化操作奠定了基础,使化合物筛选由传统的手工筛选形式转变为由计算机控制的自动化大规模筛选的新技术体系,形成了高通量化合物筛选。

   第六、是大样本量的筛选,由于化合物筛选是对未知的探索和发现过程,只有扩大筛选对象和筛选范围,才有可能发现真正高水平的药。实现了一药多筛,由于这类筛选模型消耗样品很少(μg级),可以使珍贵的样品在多个模型上进行筛选,扩大发现新药的范围。这种筛选方法符合化合物筛选和化合物发现的基本规律。

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化合物活性测试筛选-体外测试概论

更新时间:2019-10-14  点击数:112

化合物活性测试筛选指的是采用适当的方法,对可能作为化合物使用的物质(采样)进行生物活性、药理作用及药用价值的评估过程。

现在化合物活性测试筛选方法基本都是在20世纪50年代逐步发展起来的。20世纪50年代化合物发现主要是依靠细胞和动物模型,一般是表型筛选。由于对酶和酶动力学研究的不断深入,基于组织/器官的表型筛选得到了迅速发展。在这个阶段数以百计的酶被发现和纯化,成为重要的化合物发现分子靶点。20世纪70年代,酶动力学的方法学研究被延伸应用到受体药理学,受体药理学逐渐成为化合物发现的热点研究领域。20世纪80年代后期,分子生物学和基因组学的发展开启了基于分子靶点的化合物发现时代。重组DNA技术和重组蛋白质等技术方法的应用,建立了大量基于化合物作用靶点的筛选模型,可利用细胞株或生物分子的相互作用筛选庞大的化合物库。20世纪90年代,随着生命科学的发展和生物技术的进步,基于靶点的化合物发现模式逐渐取代了传统的基于化合物化学结构的发现模式,成为现代创新化合物研发的主流模式。也就是,我们能够基于某个分子靶点进行高通量筛选,可以获得小分子和靶蛋白的复合晶体结构。这些技术取得了很大的成功,今天仍然在不断丰富和发展当中。

一、体外实验

体外筛选,可以总体分为靶点水平细胞水平

1.1 靶点水平

1.1.1 酶

以酶为作用靶的高通量筛选方法,绝大多数是直接检测酶活性。具体方法根据酶的不同而不同,主要有基于放射性的方法和基于比色、荧光的方法两大类。

筛选作用于酶的化合物, 主要是观察化合物对酶活性的影响, 由于化合物与酶的相互作用也是分子间的结合, 也可以采用与靶点结合的方法进行检测。但是要根据酶的特点来决定。检测酶活性的方法很多, 酶的反应底物、产物都可用作检测指标,并可由此确定酶反应速度。

蛋白激酶(protein kinases),是一类催化蛋白质磷酸化反应的酶。它能把腺苷三磷酸(Adenosine triphosphate, ATP)上的γ-磷酸转移并共价结合到特定蛋白质分子中某些丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的羟基上,从而改变底物蛋白质及激酶的构象和活性。蛋白激酶内都存在一个同源的由约270个氨基酸残基构成的催化结构区。在细胞信号传导、细胞周期调控等系统中,各种蛋白激酶形成了纵横交错的网络,在细胞的生命活动中起了广泛的作用。

蛋白激酶按照对底物磷酸化位点的选择性,可分为受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、细胞周期依赖型激酶等。理论上凡是能检测到磷酸化产物的方法均可用于蛋白激酶的生化活性检测。但每种检测方法都需要根据激酶和底物的性质作出相应调整。

蛋白激酶抑制剂按照是否与ATP结合位点的“铰链区”结合及是否结合激酶的活性构象可分为4种类型。其中I型和II型的抑制剂构成了最常见的ATP竞争性抑制剂。

检测方法

由于以蛋白激酶作为靶点的一系列化合物的成功开发,各个试剂公司竞相开发相关的激酶检测方法和试剂盒,用于筛选和优化新的化合物作为新药候选者。其中以蛋白激酶的生化检测方法最为繁多,表3给出了一些常用检测方法、激酶抑制剂筛选试剂服务以及检测设备提供商。

图1.jpg

蛋白激酶的生化检测方法有2种不同的分类:

按照检测目标分类或者按照检测的方法学进行分类。

按照检测目标,可以分为检测ATP的消耗量、检测ADP的生成量、检测多肽底物以及检测激酶本身;

而按照检测的方法学分类,则有同位素标记分析法、质谱、核磁共振、反相高效液相色谱、毛细管电泳、生化检测方法等诸多手段。

虽然上述方法早已经见诸报道并被广泛应用,然而,现在最经常使用的还是放射性同位素标记ATP,荧光标记(包括荧光偏振\荧光共轭能量转移\时间分辨荧光以及化学发光等)检测方法。这些方法均以微孔板作为载体,具有试剂消耗量低,检测速度快,通量高的优点,成为较普遍应用的一些蛋白激酶检测方法。表4是常见的蛋白激酶生化检测方法的列举及优缺点比较。

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1.1、放射性同位素法

使用放射性同位素方法有诸多优点:它是直接检测的方法,放射性同位素的灵敏度很高,测试结果非常准确,被认为是蛋白激酶生化活性检测的“金标准”。因此,至今还有很多人继续使用放射性同位素作为检测激酶活性的方法。放射性同位素方法主要有膜过滤法和接近闪烁计数法两类。

放射性同位素方法有以下一些缺点:

(1)产生大量的放射性垃圾,对人体有一定的损害;

(2)放射性ATP的半衰期非常短,只有14天(32P)或者25天(33P),因此需要经常订购新的同位素;

(3)放射性同位素的能量非常高,有比较明显的交叉干扰现象,较难应用于化合物的高通量或者超高通量筛选。

1.2、非均相非放射性同位素法

由于放射性同位素存在上述一些缺点,科学家们开发了众多的非放射性激酶检测方法,包括酶联免疫法、高效液相色谱法、质谱法、核磁共振波谱法、毛细管电泳等。

1.3、均相非放射性同位素法

上述这些非均相的方法,存在操作繁多的问题。随着技术的发展,越来越多的均相非放射性方法开始被应用于激酶活性的检测之中,根据实验原理的不同,可以分为检测ATP的量、检测ADP的量、检测带标记或修饰的多肽底物、配体激酶结合法等。

虽然多个激酶抑制剂已经被FDA批准,作为化合物进行临床治疗,但在治疗过程中也暴露出不少问题。其中,有一个重要问题就是所谓的“脱靶效应”,即抑制剂除了靶向激酶以外,还会同时抑制其他一些非靶向激酶,并有可能引起一些细胞毒性反应。因此,必须在激酶抑制剂改造研究的前期,就增加激酶酶谱筛选(kinase profiling)。

迄今为止,已经涌现了如此众多的激酶检测方法,相信今后会有更多地方法加入其中。即使如此,由于人体激酶谱的复杂性,很难有能够适用于所有激酶检测或者适用于所有研究阶段的方法。因此,必须根据实际需要来进行相应的选择:

(1)对于高通量筛选(high throughput screening, HTS),应该尽量挑选价格便宜且信号窗口比较大的方法,同时速度快,易于操作。

(2)对于化合物优化设计阶段,应选择激酶使用量比较低的检测方法,这样检测限度也会比较低。

(3)在化合物设计中后期,必须要使用激酶酶谱进行筛选,以判断是否有“脱靶效应”。

(4)对于将要进入临床测试检验的候选化合物,要使用“金标准”放射性同位素方法进行确证。

1.1.2 受体

以受体为作用靶的高通量筛选方法,包括检测功能反应、第二信使生成和标记配体与受体相互作用等不同类型。检测功能反应的优点是易于区分激动剂和拮抗剂。经典的功能检测方法通量低,而引入基于重组技术的报告基因检测方法极大地提高了筛选通量,既高效且节省成本。

1.1.3 离子通道

离子通道功能检测依赖于对其介导的微小电流的测量,因技术手段的限制,化合物筛选通量较低成为离子通道化合物发现的瓶颈和关键步骤。研究离子通道功能的最直接方法是用膜片钳技术直接测定通过离子通道的电流或测量细胞膜电位的变化.膜片钳技术是利用一个玻璃微吸管电极完成膜片或全细胞电位的监测、钳制和膜电流的记录,通过观测膜电流的变化来分析通道个体或群体的分子活动、探讨离子通道特性。

1.1.4 核酸

以核酸为靶点主要基于当含芘的氨基甙类似物结合于RNA时,芘的荧光被淬灭的原理。在96孔板上,将芘碳酰巴龙霉素(PCP),RNA结构配成溶液后加入有受试化合物的板孔中,用荧光读板器考察荧光恢复的程度。

1.2细胞水平

细胞整体水平的筛选主要是采用鉴定杀死癌症细胞或外源性病原体包括细菌、真菌、原虫和寄生虫来筛选化合物。不同细胞活力测定法的分析试验原理涉及线粒体活性,细胞代谢或伴随活或死亡细胞酶活性。通过相对于细胞表型变化发现许多疾病特征,例如形态学变化,或在蛋白转运,表达,活性,或功能中差别。

基于细胞表型分析常进行三种类型,是细胞活力测定法,细胞信号通路分析,和疾病相关表型分析。根据细胞单一的生理反应进程可以将细胞的功能学检测方法分为4大类:

1、以细胞整体为研究对象,测定化合物作用后的最终响应情况,测定候选化合物引起细胞整理水平的变化,如细胞状态检测、分泌物检测等。

所采用的方法比较丰富多样,以整个细胞为对象测定细胞的增殖或者死亡(MTT、CCK-8、CTG、Alarmablue、ATP测定,LDH测定),细胞的蛋白组或者基因组变化(流式测定周期凋亡),细胞的转移迁移能力变化(划痕,侵袭,transwell实验),细胞分泌物的测定如PBMC细胞的TNF和IL定量测定(ELISA,TR-FRET)。
2、接收信号通路中的初始变化,测定候选化合物引起靶点蛋白最初的变化,最常见的是候选化合物和位于细胞膜上的靶点受体的结合,或者阻断靶点受体和天然配体的结合,如靶点蛋白结合

测定候选化合物引起靶点蛋白最初的变化,最常见的是候选化合物和位于细胞膜上的靶点受体的结合,或者阻断靶点受体和天然配体的结合,如靶点蛋白结合。一般而言被考虑是部分表型,信号通路分析蛋白–蛋白相互作用链接一个复杂的网络至转录激活和一个报告基因的表达(如荧光素酶,β-内酰胺酶或酶互补耦合)或荧光蛋白(GFP和YFP),产生一个可测量的发光或荧光信号。

有别于将靶点受体重组纯化出来进行亲和力评价,细胞膜上的靶点受体更接近真实的生理情况,位于细胞上的其他受体,效应蛋白可能会参与靶点蛋白的激活变化过程,更有参考价值。而且很多膜蛋白是多透膜结构,很难纯化得到完整三级结构构象的受体蛋白(如G蛋白偶联受体为7透膜)。

所采用的方法主要是Cell-Based Elisa、流式细胞术进行测定候选化合物-受体偶联物。
3、接收信号通路中信号放大变化,测定信号转导过程中信号通路中关键生物标志物的浓度,如第二信使或者激酶测定。例如GPCR(G-蛋白偶联受体)激活过程中第二信使cAMP, DAG, IP3(TR-FRET,ELISA)和 Ca 2 (FLIPR)的测定;关键效应蛋白磷酸化等修饰的浓度(TR-FRET,WB);关键酶酶浓度的测定;动力学转运过程的测定(内化)等。

       所采用的方法主要是TR-FRET,ELISA、ATP检测。
4、分析信号通路分析转录情况,测定引起细胞应答的转录和翻译水平的变化

对引起细胞应答的转录和翻译水平的测定。采用实时荧光定量PCR技术对转录RNA水平的测定;采用在启动子后面插入外源的报告基因测定转录因子的活性。

所采用的方法主要是PCR。

1.2.1 细胞增殖毒性

具体的实验就是采用MTT、CCK8、CTG等方法进行细胞活力的检测,就是检测细胞的死活数量。

细胞增殖是指细胞在周期调控因子的作用下,通过DNA复制、RNA转录和蛋白质合成等复杂反应而进行的分裂系列过程。细胞通过分裂的方式增殖,细胞增殖是生物体的重要生命特征。单细胞生物以细胞分裂的方式产生新个体,多细胞生物以细胞分裂的方式产生新的细胞,从而补充体内衰老和死亡的细胞。细胞增殖的同时,在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞,活细胞在总细胞中所占的百分比叫做细胞活力。

检测方法

检测细胞存活与增殖的方法主要包括观察DNA合成含量和检测细胞代谢活性两种,前者主要是DNA前体物质(胸腺嘧啶核苷类似物)掺入法,比如BRDU、EDU法;后者主要为MTT、XTT、MTS、CCK-8、WST-1及WST-8法等,在后者中现在最主流的就是CTG法。

图3.jpg

细胞增殖实验是化合物体外功能学筛选试验中的基本实验,在进行细胞增殖实验后,也可以进一步验证化合物对细胞转移、血管形成的影响。

这里以抗肿瘤化合物研究为例,自从上世纪80年代,美国国家癌症研究所(National Cancer Institute, NCI)逐渐建立起基于NCI-60细胞的抗肿瘤化合物体外筛选模式,是临床前筛选抗肿瘤先导化合物的有效方法,具有简单、直接、快速的优点。

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1.2.2细胞转移能力的变化

细胞的迁移运动不仅是细胞进行很多重要生理活动的基础,同时也是炎症反应和肿瘤发生等病理过程中的重要步骤和关键环节。细胞迁移 (cell migration) 也称为细胞爬行、细胞移动或细胞运动,是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。细胞迁移是正常细胞的基本功能之一,是机体正常生长发育的生理过程,也是活细胞普遍存在的一种运动形式。胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。细胞的转移迁移能力变化主要涉及的实验分为2类,一类是划痕,侵袭,另一类是Caco-2、PAMPA、MDCK。

检测方法

细胞划痕实验

是一种操作简单,经济实惠的研究细胞迁移能力的体外试验方法。其原理是,当细胞长到融合成单层状态时,在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域,即为“划痕”,划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。通过对不同时期划痕区域细胞状态的观察,对细胞的迁移能力进行判断。

细胞侵袭实验

主要是针对肿瘤细胞而言,通过侵袭实验可以研究各种细胞因子对肿瘤细胞侵袭和转移的影响,会应用到一些抑制血管生成的新药研究中,也会在研究肿瘤细胞侵袭和转移的机制中。

试验中很多人可能会混淆划痕与侵袭,不知道什么情况下进行哪一种实验,说明下的是看你研究的细胞类型咯,针对肿瘤细胞的实验,进行细胞侵袭检测,即进行transwell实验,监测通过细胞外基质的运动,往往比划痕实验更重要,所以优先考虑侵袭实验,辅以细胞划痕实验,如果是其他细胞呢,往往进行细胞迁移能力评价的实验,即细胞划痕就可以了。

Caco-2、PAMPA、MDCK这3种细胞通透性的实验是一类,他们的研究可以获得很多信息,可更加细致的了解化合物的透膜过程,包括蛋白的结合、溶酶体、酶和转运体等因素对透膜的影响。

Caco-2 cell monolayer

Caco-2 细胞系来源于人结癌,用以模拟化合物经小肠上皮的吸收过程。特点: Papp 与人小肠吸收相关性好。

主要用途:

1、研究化合物吸收转运机制;

2、新药筛选,预测生物利用度。

PAMPA(Parallel artificial membrane permeation assay)

是一种非细胞的体外透膜性研究方法,以卵磷脂膜代替细胞层,适于确定化合物脂溶性扩散。

对PAMPA实验结果与细胞实验结果进行分析比较, 能简便快速的确定化合物的转运是否存在被动扩散与其他转运方式。

MDCK cell monolayer

MDCK ( Madin Darby Canine Kidney) cells为肾远曲小管上皮细胞,是研究细胞调节、代谢,抗流感病毒研究的常用模型。 和 Caco-2 细胞一样,在半透膜上分化成柱状上皮单层,细胞间形成紧密连接,构成化合物转运的细胞屏障。与Caco-2相比,二者相关性好。

主要用途:

1、研究化合物肾小管重吸收机制;

2、新药筛选,代替Caco-2预测生物利用度;

3、血脑屏障模型研究。

1.2.4 细胞分泌物的测定

如单核细胞、免疫细胞等的TNF和IL定量测定(采用ELISA或TR-FRET方法进行检测),在与炎症相关的化合物筛选研发中运用的相当广泛。

检测方法:LDH分析、ELISA、TR-FRET、流式细胞术进行测定候选化合物-受体偶联物

1.2.5 细胞基因表达的变化

化合物对细胞的影响,可以在核酸水平上对目标基因的表达进行改变。

检测方法:PCR

体外测试与体内测试相比,首先是降低了筛选样品的用量。用整体动物进行化合物筛选,对样品的需求量一般在1-5g以上(根据用量和动物大小),而采用体外筛选模型筛选化合物,样品用量一般仅需整体动物的1/10-1/100或更少;

第二、降低劳动强度,扩大筛选规模,减少动物用量,特别是有些模型仅使用一小部分组织或者细胞,同一时间内可以进行多样品的筛选,提高了筛选效率,降低了筛选成本。

第三、减少了影响化合物作用的因素,易于评价化合物作用。

第四、细胞、分子水平的化合物筛选模型具有材料用量少、化合物作用机制比较明确、可实现大规模的筛选等特点,已经成为目前化合物筛选的主要方法。

第五、细胞分子水平化合物筛选模型的应用为自动化操作奠定了基础,使化合物筛选由传统的手工筛选形式转变为由计算机控制的自动化大规模筛选的新技术体系,形成了高通量化合物筛选。

   第六、是大样本量的筛选,由于化合物筛选是对未知的探索和发现过程,只有扩大筛选对象和筛选范围,才有可能发现真正高水平的药。实现了一药多筛,由于这类筛选模型消耗样品很少(μg级),可以使珍贵的样品在多个模型上进行筛选,扩大发现新药的范围。这种筛选方法符合化合物筛选和化合物发现的基本规律。

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